支持中心

简体中文

English

简体中文

English

Appearance

基础分析 - scRNA ​

作者: SeekGene
时长: 12 分钟
字数: 3.2k 字
更新: 2026-01-26
阅读: 0 次
SeekSoul Online

空间基础分析前言 ​

查看更多内容（展开/收起）

细胞质控 ​

  • 细胞层面过滤（表达矩阵）

    • 推荐使用 UMI 总数、检测到的基因数、线粒体比例三类指标联合筛选；根据样本组织类型自适应阈值。
    • 在 SeekSpace 流程中，常用 --forceCell 与 --min_umi 进行初筛（例如默认提取前 80,000 个 UMI 并过滤 UMI < 200 的条形码）。如组织复杂或背景高噪时，适当提高 --min_umi。

  • 空间特异的条形码清洗（关键）

    • 过滤“无效的 spatial barcode”（表达文库短片段误入、测序错误等导致在 HDMI 库无位置信息的条形码）。
    • 处理“重复且位置不一致”的 spatial barcode：无法唯一定位者剔除。
    • 清除“异常高支持”的空间条形码簇：将芯片按网格（如 30×30 像素 bin）统计，识别并移除疑似脱片/飞溅造成的异常热点（优先剔除该 bin 中 UMI 最高的 cell barcode 对应的 spatial barcode）。
    • 最终仅保留通过细胞判定的 cell barcode 及其对应的有效 spatial barcode。

  • 唯一中心性检查（多中心细胞过滤）

    • 基于细胞在空间上的 UMI 分布，定义“中心 bin”与“核心区域”，计算核心与次中心的 UMI 比值（≥ 2 判定为唯一中心）。
    • 剔除多中心细胞，降低条形码混溢或核碎片导致的定位歧义。

空间映射 ​

  • 三库协同（以 SeekSpace 为例）

    • 表达文库：用于纠错细胞条形码、提取 UMI、生成表达矩阵。
    • 空间文库：Spatai 文库 R2 带有空间位置 32bp barcode：在 R2 上提取 spatial barcode，并生成细胞标签 (cell barcode) 与空间标签 (spatial barcode) 的对应关系。空间文库的 UMI (spatial UMI) 代表了每个细胞标签上每个空间标签的表达量。
    • HDMI 文库：包含 32bp 空间条形码及其绝对坐标；获得的 reads 前面是 32bp 的空间 barcode，后面是对应的空间坐标信息。

  • 校正与配准流程

    • 条形码层面：
      • 细胞条形码/UMI 纠错（允许/禁止错配可配置，如 --skip_misB 等）。
      • 空间条形码白名单化与纠错，绑定至 HDMI 坐标。
    • 图像层面：
      • 组织图像（DAPI/HE）进行缩放与模糊预处理，分割组织区域。
      • 若自动配准不理想，可人工对齐并保存参数（如 parameters.json），再以“realign”流程复用，生成一致的背景掩膜与对齐图。

  • 空间坐标确立与细胞位置判定

    • 依据每个 cell barcode 关联的空间条形码的坐标密度，统计在网格 bin 上的 UMI 分布；以最大密度 bin 为细胞中心，并结合核心-次中心比值校验唯一性。
    • 输出 cell_location.tsv.gz 记录细胞在芯片坐标系中的位置，实现表达矩阵的空间锚定与可视化叠加。

以上详细内容可以查看 [SeekSpace® Tools](../../../Software/2_SeekSpace® Tools/3_v1.0.2.html)

SeekSpace® Tools 生成的结果文件可直接用在云平台进行后续分析。

初始阶段 ​

  1. 【新建流程】创建单细胞分析流程。项目开始一般选择样本进行大群分析，后续可选择注释好的细胞类型进行亚群分析。
  1. 填写“流程名称”及“流程描述”，用于后续查找和了解流程信息。
  1. 【选择数据】选择待分析的样本，可选择已经整合好的多样本数据，也可选多个单样本进行过滤整合。

NOTE

数据详细来源可查看《我的数据》。

  1. 【分组】对样本添加分组信息（选填），后续模块也可添加分组信息，详情可见“画图工具”添加标签功能和“差异富集”分组功能。
  1. 填写信息，选择待分析的数据，可以选择【开始分析】手动进行过滤整合和聚类，也可以选择【基础分析】、【基础分析+细胞注释】、【基础分析+细胞注释+差异富集】或【基础分析+细胞注释+差异富集+画图工具】快速进行自动分析。

过滤 ​

  1. 【开始分析】后的“图表数据”会统计样本 UMI、线粒体占比及基因表达情况，简要展示各样本质量信息。

NOTE

指标释义（scRNA-seq）：

  • nCount_RNA：每细胞 UMI 总数，反映测序深度与转录本丰度
  • nFeature_RNA：每细胞检出的基因数，反映表达复杂度
  • 线粒体比例（mito）：线粒体基因 UMI 占比，偏高常与凋亡/损伤相关（高代谢组织可适度放宽）
  1. 展开按钮可查看默认参数，用户可参考已发表单细胞文章方法中的过滤参数进行【过滤】。

TIP

如果选择的是已经整合的数据，点击【过滤】会提示是否需要跳过过滤整合步骤。如果不需要调整参数可跳过进行后续分析，如需调整过滤阈值则取消跳过，重新进行过滤整合。

IMPORTANT

过滤策略建议：

  • 使用 MAD 动态阈值过滤 mt% 或以 10%-20% 作为参考上限。
  • nCount_RNA/nFeature_RNA 以分位数或箱线图上界识别极端异常。
  • 多样本时可按样本细胞数做均衡抽样，避免样本量主导聚类。
  • 高代谢组织（心/肾/肝等）与免疫/粒细胞丰富样本需适当放宽阈值，避免误删真实细胞。
  1. 【过滤】后可查看各样本过滤后质量信息，同时可对单样本进行个性化调整，保证整体样本质量一致。

CAUTION

避免机械性依赖“拉高细胞数”的操作（如仅凭经验值强行放宽下限）。若瀑布图拐点不清、背景高或低 UMI 群占比异常，强行回收会降低下游稳定性。 双胞（doublet）排查思路：

  • 识别 nCount_RNA/nFeature_RNA 上尾细胞（分布右侧极端高值）。
  • 是否存在互斥 marker 共表达、UMAP 两团之间的“桥状”细胞。
  • 肿瘤项目可结合 CNV 辅助判定。
  • 谨慎过滤：建议多证据一致时再剔除，并在剔除后重做整合与聚类验证一致性。

整合 ​

  1. 质控合格的数据进行【整合】，目前提供四种整合方法，其中 CCA、Harmony 和 RPCA 会对多个样本进行批次矫正。
  1. 【整合】后会展示样本整合情况，可调整整合参数重新整合。建议用户尝试多种整合方法，选择更合适的方法进行后续分析。

TIP

整合方法选择：

  • 批次效应较弱：merge 直接合并，避免过度校正。
  • 中等批次：CCA/RPCA。
  • 批次显著或异构明显：Harmony 更稳健。

TIP

效果评估三准则：

  • 批次混合度：同一细胞类型在 UMAP/t-SNE 中跨样本均匀混合。
  • 生物信号保留：经典 marker 梯度与分群边界清晰，差异/富集结果符合预期。
  • 过度/欠校正告警：过度校正会抹平差异，欠校正会出现“按批次聚类”。

聚类 ​

【整合】确认后进行【聚类】，可新建选择多个分辨率进行聚类，分辨率越大分群数量越多。后续模块也可新增分辨率进行聚类。

TIP

聚类调参与排错：

  • 拐点法：以 PCA 肘部拐点作为 dims 起点，细胞量越大适当增加。
  • 子集重聚类：如 T 细胞等大类单独重聚类，放大类内异质性。 dims 过低会遗漏关键异质性，过高易过聚类与放大噪音。请结合拐点与重现性优选。

空间聚类与 RNA 聚类整合 (非必需) ​

查看更多内容（展开/收起）

  • Banksy 与 RNA 聚类的关系

    • RNA 聚类仅基于基因表达，擅长区分细胞类型/状态，但可能忽略空间连续性与微环境线索。
    • 空间聚类引入邻域依赖与空间梯度，擅长识别组织功能域与边界，但可能牺牲部分表达分辨率。
    • Banksy 在表达特征上叠加邻域统计特征（如邻域均值/梯度），通过可调权重进行联合聚类，用于“修正/细化”RNA 聚类边界、合并空间上不连续的伪簇，或揭示被 RNA 聚类忽略的空间功能域。

  • 整合思路（基于云平台工作流）

    • 云平台 RNA 聚类基线 → 导入 Banksy CSV → 一致性评估与差异富集
      • 在云平台完成标准 RNA 聚类，得到表达层的基线标签。
      • 获取高级分析 Banksy 结果 CSV（如 XXX_banksy_colData.csv），通过“上传合并 meta”并入流程 meta（须包含 barcode，列名避免与流程内置字段冲突）。
      • 在平台上对比 RNA 基线与 Banksy 簇/空间域的一致性（NMI/ARI、空间连通性/断裂率、域内表达同质性），并以 Banksy 或一致性优化后的标签为分组做差异表达、富集（GO/KEGG/通路）与空间可视化。

    TIP

    （为何与如何整合）：

    • 基于“自身表达 + 空间微环境表达”联合建模：表达决定“它是什么”，空间决定“它在哪里、它做什么”。
    • 能识别具有特定空间位置的细胞亚型：揭示仅在特定区域出现的功能性细分亚群。
    • 利用邻居信息作为佐证提高置信度：邻域一致的表达模式可帮助合并伪簇、削弱噪声。
    • 聚类结果更自然地对齐空间区域：更好地对应组织学结构与形态学边界。

    Banksy 并不是替代传统单细胞注释的方法，而是一个强大的增强工具：在既有的 RNA 基线之上注入关键的空间维度，把对细胞身份的理解从“它是什么”推进到“它在哪里、它做什么”的更高层次。

  • 关键参数与实践建议（云平台参数面板）

    • algo：聚类方法，支持 leiden、louvain、kmeans、mclust。
    • 分辨率/簇数：
      • leiden/louvain 用 resolution（越大簇越多，结合空间连通性与 marker 解释性微调）。
      • kmeans 用 kmeans.centers；mclust 用 mclust.G（均为簇数）。
    • lambda：表达与空间位置的权重；0 表示不引入空间，常用 0.1–0.3，结构清晰可略升，噪声大/稀疏样本可适度降低避免过度平滑。
    • 主成分数量：用于构建特征空间的 PC 数，默认 30，数据规模大或异质性强可适度上调。

TIP

调参建议：

  • 先在 RNA 聚类上确定稳定的表达基线，再在小范围内网格化尝试 lambda 与分辨率（或簇数）组合。
  • 优先选择兼顾较高 NMI/ARI 与更低空间断裂率的结果；当 NMI 略降但空间域更连续且 marker 更一致时，倾向选择 Banksy 标签。

TIP

实践建议：先固定 RNA 分辨率获得稳定的表达基线，再调节 lambda 与 k_geom 观察空间连通性与 NMI 的变化；当 NMI 下降但空间断裂率显著降低且 marker 呈现更清晰的空间域时，优先选择 Banksy 标签。

  • 一致性、解释性与交付
    • 一致性：报告 NMI/ARI、空间断裂率、域内表达同质性与空间自相关（如 Moran's I）。
    • 可解释性：建立 Banksy 簇与 RNA 类型的映射，核验域内 marker、组织学区域与已知结构的一致性。
    • 结果交付：
      • 输出“RNA 类型 × 空间域”的交叉表与并排可视化（UMAP 与空间坐标）。
      • 基于差异与富集结果，附上显著通路与代表基因的空间热图，阐明空间功能差异。

分析完成 ​

【聚类】后无需调整则点击【完成】，跳转“细胞注释”模块，正式开始进行单细胞相关分析。该步会耗费一定时间，请用户耐心等待。

0 条评论·0 条回复